20 dec 2019

Hybridoma VS Display : Le combat du 20ème siècle ?

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Une fois que vous avez (enfin !) identifié votre antigène et que vous voulez développer un nouvel anticorps monoclonal contre cette cible, les mêmes questions reviennent encore et toujours: “Dois-je utiliser une technique de Display ou un hybridome traditionnel pour générer mon nouvel anticorps ? Quelle technique me permettra d’obtenir la plus grande affinité ? Mais en ce qui concerne la vision à long terme, quelle est l'approche la plus sûre pour les années à venir ?”
Abordons donc ces questions l'une après l'autre en nous remémorant l’historique des procédures de génération d'anticorps monoclonaux.
Un article du groupe mAbexperts, acteur majeur pour le développement des anticorps monoclonaux et recombinants.

La découverte de la technologie des hybridomes

La génération des hybridomes a été développée pour la première fois en 1975 par George Köhler et César Milstein. Elle repose sur la fusion des cellules B immunisées de souris avec les cellules d’un myélome. Les cellules B immortelles produisant l'anticorps d'intérêt sont ensuite sélectionnées et les meilleurs clones sont criblés afin d'obtenir des anticorps monoclonaux présentant la meilleure affinité antigénique.

Peu de gens le savent, mais à la même époque Hervé Bazin a créé la lignée cellulaire de myélome de rat IR983, permettant la première génération d'anticorps monoclonaux de rat à Louvain-la-Neuve, en Belgique, donnant ainsi naissance à la société SYnAbs.

En général, le développement d'hybridomes provenant de nouvelles espèces est limité en raison de l'absence de partenaire de fusion. La fusion d'une cellule B d'une espèce avec une lignée cellulaire de myélome d'une autre donnera naissance à des clones dits hétéro-hybridomes qui seront progressivement perdus lors de l'étape de sélection clonale en raison de leur instabilité génétique.

 Le développement d'hybridomes reste l'une des méthodes traditionnelles les plus robustes, puisque :

• il permet de produire des anticorps monoclonaux d'une manière peu complexe,
• l'origine mammifère des cellules intègre des modifications post-traductionnelles in vivo, ce qui diminue le risque d'agrégation potentielle,
• il permet la production d'anticorps monoclonaux hautement spécifiques contre un seul épitope de l'antigène cible,
• une maturation naturelle de l’affinité se produit chez l'animal. Des processus complexes de recombinaison in vivo assurent l’arrangement optimal des domaines variables et constants, ce qui donne des anticorps avec des caractéristiques d'affinité très élevées.

Diaclone développe depuis plus de 30 années des hybridomes murins et a su s’imposer sur ce marché, avec l’optimisation et l’adaptation des voies d’immunisation et des méthodes de criblage en fonction de l’antigène et des applications visées, compétences complétées par le savoir-faire de SYnAbs tout particulièrement dans le cas de petites molécules ou d’antigènes complexes.

Les limites de la technologie des hybridomes

Cependant, l'utilisation de la technique d'hybridome comporte certains inconvénients importants :

• Le processus reste long, il faut compter 3 à 4 mois pour obtenir un clone d'hybridome à partir de la date d’immunisation.
• L'origine animale des anticorps implique une humanisation plus poussée pour des fins thérapeutiques.
• L'étape de criblage est connue pour être très laborieuse et délicate.

D'autres limitations sont directement liées à la nature de l'antigène :

• Les antigènes sensibles (GPCR, composés intracellulaires, épitopes conformationnels...) sont difficiles à cibler.
• Les antigènes toxiques peuvent tuer l'animal hôte avant même que les anticorps ne soient produits.

Pour surmonter ces limitations, SYnAbs a développé une technique d'immunisation de l'ADN permettant l'expression de l'antigène natif et le criblage sur cellule en FACS.

• Enfin, on sait que les hybridomes peuvent subir une dérive génétique qui entraîne une variabilité d'un lot à l'autre.

Avec les techniques de séquençage, il est maintenant possible de séquencer les hybridomes afin de conserver les gènes d'intérêt dans un vecteur plasmidique. RD-Biotech a su imposer son expertise dans ce domaine et propose le séquençage des chaînes lourdes et légères d’anticorps monoclonaux, permettant le passage vers l’anticorps recombinant et d'autres systèmes d'expression (cellules mammifères CHO, HEK notamment.

L'essor du Phage Display

Mais au-delà des limites évoquées, comment pouvons-nous :

- explorer des répertoires humains ou des répertoires d'espèces qui n'ont pas été encore utilisées pour la production d'hybridomes ?

- effectuer d'autres manipulations génétiques des sites de liaison, c'est-à-dire travailler la maturation de l'affinité, l'optimisation de la spécificité... ?

Face à ces défis, G.P. Smith a introduit en 1985 le concept d'affichage de protéines exogènes à la surface d'un bactériophage filamenteux M13, montrant le potentiel de la constitution de banques de phages présentant de grands répertoires de protéines différentes. Les banques d'affichage d'anticorps ou Phage Display sont devenues l'application la plus réussie de ce concept ; Diaclone a ainsi développé sa plate-forme de de développement d’anticorps recombinants murins par Phage Display, offrant de nouvelles opportunités notamment en immunothérapie.

Un phage présentant un anticorps spécifique à sa surface peut ainsi être isolé pour sa propriété de liaison à un ligand cible à partir d'une collection de milliards de phages présentant différents anticorps. Puisque le gène de la protéine du phage affiché est présent dans le génome du phage, la sélection d'un virus permet la récupération du gène de l'anticorps correspondant.

• Contrairement aux techniques d'hybridomes, lorsqu'une banque naïve est disponible, le processus de sélection peut être très rapide et ne dure généralement que quelques semaines,
• Lorsqu'une bibliothèque est configurée, elle peut être utilisée plusieurs fois et faire l'objet de nouvelles sélections des années plus tard,
• L'affichage de phages est couramment utilisé pour la toxicologie et la recherche sur les anti-venins en raison de sa capacité à faciliter le travail avec les antigènes toxiques et non immunogènes,
• L'affichage des phages a un débit beaucoup plus élevé que l'hybridome, car des banques de phages de plusieurs milliards peuvent être screenés.

Les limites du Phage Display

Mais le Phage Display n'est pas la solution parfaite :

• La méthode est coûteuse et nécessite un ensemble d’expertises techniques plus complexes que l’approche hybridome,

• Il reste une probabilité élevé que les anticorps puissent présenter une affinité modérée pour les cibles lors du screening de banques naïves. Par conséquent, ces banques doivent être de très grande taille, ce qui rend la génération de bibliothèques naturelles naïves très laborieuse. Les banques hyper-immunes contre un antigène spécifique sont une solution potentielle, QVQ possède une expertise reconnue dans ce domaine, avec la génération de fragments d’anticorps VHH dérivés d’anticorps de lamas.

• Une autre limitation des banques d'anticorps peut être l'appariement aléatoire VH-VL. Ceci peut potentiellement conduire à la production de molécules d'anticorps ayant des caractéristiques biophysiques sous-optimales et induire des problèmes de développabilité (agrégation, manque de solubilité,...).

• Le Phage Display produit des fragments d'anticorps scFvs ou Fabs qui ne peuvent pas recruter des composants du système immunitaire pour des effets cytotoxiques ADCC et/ou CDC.

Mais alors qui est le vainqueur du match “Hybridome VS Phage Display”?

Dans le développement d'anticorps, il n'existe pas de concept de "taille unique " et, comme l'a récemment démontré Diaclone avec la génération d’anti-IL8 (en cours de publication), les technologies de Display et d'Hybridomes sont des approches complémentaires qui peuvent augmenter considérablement le taux de succès du projet.

Le groupe mAbexperts, qui réunit l’expertise, l’innovation, l’expertise et le savoir-faire des sociétés RD-Biotech, Diaclone, SYnAbs et QVQ, a aujourd’hui la vocation de devenir un acteur incontournable dans ce domaine.

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